Fluorimetri

Fluorimetri er kvantitativ analyse av fluorescence, emittert fluoriserende lys, fra atomer/molekyler. Fluoriserende atomer/molekyler kalles fluoroforer.

Molekyler som fluoriserer - dobbeltbindinger (ikke alle) - stabile og plane ringstrukturer

Absorpsjon av synlig/UV-lys med en bølgelengde (λ) hvis energi (E) eksakt tilsvarer energidifferansen mellom S0 og S1 som medfører eksitasjon av et elektron fra grunnivå S0  til første eksitasjonsnivå S1 (se figur 1). Det eksiterte elektronet er ustabilt og taper noe av  sin energi i form av vibrasjon og rotasjon (VR). Elektronets tilbakefall til grunnnivå  S0 medfører deretter frigivelse av fotonenergi i form av synlig/UV-lys. Denne fotonenergien er definert som fluroescence.
 * Fluorescence**

 Figur 1. Kvantemekanikk bak fluorescence

Eksitasjonsbølgelengden (λex) er høyere i energi (E) enn emisjonsbølgelengden (λem) som følge av tapt energi i form av vibrasjon og rotasjonsenergi. Dette medfører også at λex < λem.

**Stokes Shift** Differanse mellom eksitasjonsenergi og emisjonsenergi som representerer energien som  tapes som vibrasjon og rotasjon (VR).

ΔE = Eex-Eem

**Spektrofluorimeter** Et spektrofluorimeter er et instrument som benyttes til kvanitativ analyse av fluorescence. Spektrofluorimeterets grunnleggende komponenter er illustrert i figur 2.Eksitasjonsmonokromatoren siler ut et bestemt bølgelengdeområde fra eksitasjonskilden som sendes inn mot kuvetta hvor eksitasjonslyset absorberes av en bestemt fluorofor. Høyintensitets eksitasjonslys er kritisk for sensitivitet da fluorescence øker med økt intensitet på det innfallende lyset. Det brukes derfor ofte xenon lampe eller laser som eksitasjonskilde i spektrofluorimetere. Emisjonsmonokromatoren siler deretter ut en del av emisjonslyset (fluorescence) som sendes ut fra kuvetta i alle retninger. Signalet forsterkes og detekteres av en detektor, ofte en fotomultiplikator, hvor singalet genererer en elektrisk strøm som er proporsjonal til målt emisjonsintensitet.

Figur 2. Komponenter i et spektrofluorimeter

Det geometriske oppsettet eliminerer bakgrunsstøy som strølys.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**Konsentrasjonsbestemmelse i fluorimetri** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Fluorescence er direkte proporsjonal med konsentrasjon av fluorofor. Følgende sammenheng er <span style="font-family: Times New Roman,serif;">derviert fra Lambert-Beers lov og er gyldig for fortynnede løsninger hvor A < 0,05.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;"> F = KΦP(0)abc

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">F : fluoresence intensitet i % <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Φ: fluorescence effektivitet. Forhold mellom emitert lys og absorbert lys. Kvanteutbytte <span style="font-family: Times New Roman,serif;">P(0): eksitasjonsintensitet <span style="font-family: Times New Roman,serif;">a: molar absorbitivitet <span style="font-family: Times New Roman,serif;">b: volumenhet inne i kuvetta definert av det geometriske oppsettet mellom eksitasjonsspalte <span style="font-family: Times New Roman,serif;">og emisjonsspalte. <span style="font-family: Times New Roman,serif;">c: konsentrasjon i mol/L <span style="font-family: Times New Roman,serif;">K: stigning/sensitivitet

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">Φ, P(0), a og b holdes konstante

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**Φ** **Kvanteutbytte** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Antall fluorescence emisjoner pr. foton som absorberes av fluoroforen. <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Kvanteutbyttet er en stoffkonstant. Altså, karakteristiske for ulike fluoroforer.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">__A____ntall emitterte fotoner__ <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Antall absorberte fotoner

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**E****ksempel:** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Et kvanteutbytte på 100% (Φ=1) betyr at hvert eneste absorberte foton medfører i et emittert foton. <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Et kvanteutbytte på 0% (Φ=0) betyr at ingen absorberte foton har medført i et emittert foton. Stoffer som har Φ = 0 er altså ikke fluoriserende.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">Det eksiterte elektronet kan henfalle (deaktiveringsprosesser) til grunnstilstanden gjennom rekke mekanismer. Henfall ved tap av eksitasjonsenergi i forbindelse med vibrasjon/rotasjon og fluroescence er eksempel på to slike mekanismer. Det finnes også andre mekanismer som resulterer fra noe som kalles (intersystem crossing, som blant annet kan medføre i phosforescence). Det viktigste er at disse mekanismene har det til felles at de er karakteristert med hver sin hastighetskonstant K. De inntreffer med ulike hastigheter. Kvanteutbyttet sier noe om prosentandelen av de eksiterte fluoroforene som deaktivieres gjennom fluroescence prosessen i forhohld til andre deaktiverende prosesser.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">Φ = Kf/(Kf + Ki + Kx)

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">Kf: fluorescence <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Ki: ikke-strålende henfall <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Kx: intersystem crossing

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**Bølgelengdeskan** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">I en fluorescence analyse er man interressert i å vite noe om hvilken eksitasjonsbølgelengde <span style="font-family: Times New Roman,serif;">som gir høyest relativ fluorescence hos fluoroforen.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">Eksitasjonsmonokromatoren sender eksitasjonslys av alle bølgelengder inn på kuvetta samtidig som emisjonsmonokromatoren står helt åpen. Eksitasjonsspekteret viser da sammenhengen mellom eksitasjonsbølgelengde og intensitet på emisjonslyset som vist i figur 3.
 * <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Eksitasjonsspekter **

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">Toppen med høyest intensitet representerer den eksitasjonsbølgelengden som gir høyest relativ fluorescence.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**Emisjonsspekter** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Eksitasjonsmonokromatoren stilles inn på den eksitasjonsbølgelengden som gir høyest relativ fluorescence samtidig som emisjonsmonokromatoren siler ut den bølgelengden med høyest intensitet (se figur 3).

Figur 3. Forenklet eksitajsons og emisjonsspektrum. Eksitasjonsspekteret til venstre og emisjonsspekteret til høyre.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">Når egnet eksitasjonsbølgelengde og emisjonsbølgelengde er bestemt, <span style="font-family: Times New Roman,serif;"> stilles de respektive monokromatorene inn på disse bølgelengdene. <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Intensiteten på emisjonslyset vil da være proporsjonal med konsentrasjonen av fluorofor.
 * <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Prinsipp for instrumentell avlesning **

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**B****egrensninger i fluorimetri** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">I forbindelse med fluorimetri er det en rekke begrensninger knyttet til konsentrasjonseffekter <span style="font-family: Times New Roman,serif;"> (indre filter effekt og quenching), Matrix effekter (uspesifikk fluorescence, lysspredning) og temperatureffekter.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">Det lineære foholdet mellom konsentrasjon og fluorescence intensitet er gyldig når prøveløsningene absorberer mindre enn 2% av eksitasjonslyset. Altså når A < 0,05.Ved fortynnede løsninger som absorberer < 2% av eksitasjonslyset, er fluorescencen uniformt fotrdelt over eksitasjonslysets strålegang gjennom kuvetta (se figur 4). Høye konsentrasjoner av fluorofor medfører økt absorpsjon av eksitasjonslyset tildlig i strålegangen som medfører redusert intensitet i strålegangen over kuvetta (se figur). Noe som fører til at fluorescencen ikke fordeles uniformt over strålegangen. Da det typiske måleområdet er i midten av kuvetta, vil detektoren ved høyere konsentrasjoner av fluorofor oppfatte en lavere intensitet enn den sanne intensiteten som da er lokalisert i starten av strålegangen.
 * <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Indre filter effekt **

Figur 4. Til vesntre: Indre filtereffekt ved høy konsentrasjon.P0 er eksitasjonslys inn mot kuvetta.Grønn farge representerer fluorescence Til Høyre: sammenhengen mellom %F og konsentrasjon ved økte konsentrasjoner.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">Indre filter effekt kan minimaliseres ved å bruke fortynnede løsninger eller rette måleområdet mot ytterkanten av kuvetta som vist i figur 5.

Figur 5. Til venstre: Minimalisering av indre filter effekt ved å skifte måleområdet mot ytterkanten av kuvetta. Til høyre: typisk måleområde.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**Quenching «slukking»** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Ved høye konsentrasjoner vil eksiterte molekyler interaktere signifikant med hverandre og slik medføre at energi tapes gjennom andre mekanismer enn fluorescence. Quenching kan og være et resultat av tilstedeværelse av stoff som hindrer fluorescence. Et eksempel er Cl-.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**Raman og Rayleigh l****ysspredning**

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**Rayleigh** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Fluoroforer som har små ΔE har overlappende eksitasjons og emisjonsspektrum som medfører at signaldeteksjonen er veldig følsom overfor strølys. Lysspredningen som inntreffer innebærer ingen endring i bølgelengde. Bruk av godt definerte emisjons og eksitasjons interferensfiltre kan minimalisere denne lysspredningen.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**Raman** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Lyssprendingen er uavhengig av eksitasjonsbølgelengden og er et resultat av løsemiddelets egenskaper. Lysspredningen inntreffer med en forlenget bølgelengde i forhold til eksitasjonsbølgelengden.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**Temperatur** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Φ for mange fluoroforer er sensitiv overfor temperaturendringer. Temperaturen bør derfor være regulert innenfor ± 0,1 °C ved fluorimetriske analyser. Den relative intensiteten på fluorescencen vil også reduseres med økende temperaturer med ca. 1-5 % per celsius grad.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**Matrix** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Serum/urin inneholder mange komponenter som er fluoriserende. Spesielt proteiner og bilirubin.

<span style="font-family: Times New Roman,serif;">**Referanser** <span style="font-family: Times New Roman,serif;">1. Burtis CA. m.fl. TIETZ, Fundamentals of clinical chemistry. 6.utg.USA: Saunders Elsevier; 2008 <span style="font-family: Times New Roman,serif;">s. 72-79. <span style="font-family: Times New Roman,serif;">2. Tutorial on Fluorescence and Fluorescent Instrumentation. Sitert den 15.11.2013. Tilgjengelig <span style="font-family: Times New Roman,serif;">fra: [] <span style="font-family: Times New Roman,serif;">3. Mueller Joachim. Quantum Yield and Polarization. Sitert den 15.11.2013. <span style="font-family: Times New Roman,serif;">Tilgjengelig fra:[] <span style="font-family: Times New Roman,serif;">4. Drogset <span style="color: #000000; font-family: Times New Roman,serif;">, Siri. Fluorescence. Publisert 19.08.2013 på Itslearning.